Chemische reacties nu te volgen met FCS-STED-microscoop

Fluorescentiecorrelatiespectroscoop

Het principe van een fluorescentiecorrelatiespectroscoop[ (afb: WikiMedia Commons)

 Het is scheikundigen er veel aan gelegen te weten hoe scheikundige reacties verlopen. Op dat terrein zijn de laatste tijd wel vorderingen gemaakt, maar het lijkt er nu op dat onderzoekers in Polen een methode hebben ontworpen om een chemische reactie van nabij te volgen. Daarvoor gebruikten ze een microscoop met een hoge resolutie terwijl de reacties in minieme hoeveelheden vloeistof plaatsvinden. Zo zouden ze ook reacties in levende cellen kunnen volgen en zelfs celkernen. De crux zit hem in hun nieuwe rekenmodel.

De onderzoekers werkten voor het instituut voor fysische chemie van de Pools akademie van wetenschappen in Warschau. Samen met de Duitse onderneming PicoQuant GmbH een nieuwe microscopische techniek, die is vooorzien van de erg onhandige aanduiding superresolutiefluorescentiecorrelatiespectroscoop (en dan drie keer woordwaarde).
“We werken al lang aan chemische reacties in cellen. Zo hebben we in 2013 de diffusiecoëfficiënten van alle eiwitten in de Escherichia coli-bacterie bepaald. Daardoor is het mogelijk geworden om reactiesnelheden te bepalen. Nu waren we geïnteresseerd in iets soortgelijks, maar dan bij heel lage concentraties”, zegt onderzoeker Robert Holyst.
“Biologische reacties zijn meestal omkeerbaar en, als dat gebeurt, ontstaat er meestal een dynamisch evenwicht. Om die evenwichtsconstanten te kunnen bepalen hadden w

e een hoogoplossende fluorescentiemicroscoop in gedachte. We liepen tegen een interessant technisch probleem aan en de oplossing daarvan bleek nieuwe mogelijkheden te bieden bij het bestuderen van de scheikunde van het leven, de biochemie.”

Er zijn vele vormen van microscopie en het is tegenwoordig zelfs mogelijk tot op het niveau van afzonderlijke atomen te ‘kijken’. Bij het bestuderen van levende systemen is de optische microscopie nog steeds onverslaanbaar, stelt de Poolse onderzoeker. Zo’n optische microscoop verstoort het object weinig en je kunt er de ruimtelijke structuur van levende organismen mee in beeld brengen. Tot voor niet zo heel lang geleden was het geringe oplossende vermogen een grote sta-in-de-weg. De resolutiegrenzen werden bepaald door de golflengte van het gebruikte licht (wet van Abbe).https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jpclett.7b02742

Fluorescentiemicroscoop

Daar viel een mouw aan te passen en de fluorescentiemicroscoop is daarvan het resultaat. Daarbij gebruik je fluorescerende stoffen, waarbij je je monster met een laserstraal aftast. De fluorescerende stoffen op de plaatsen die je wilt onderzoeken worden ‘verlicht’ door die laser. In 1994 ontwikkelde Stefan Hell een STED-microscoop waarmee hij de diffractielimiet doorbrak. Daarvoor gebruikte hij een tweede laser met een bundel waarin in het midden een ‘gat’ zit. Met die tweede lichtbundel wordt als het ware een deel van de lichtvlek van de eerste bundel uitgedoofd. Met deze truc is in feite, afhankelijk van het vermogen van de ‘uitdooflaser’, een oneindig kleine resolutie te verkrijgen, maar tot 10 nm is met de STED goed te doen.
Nieuwer is de fluorescentiecorrelatiespectroscopie, waarmee de bewegingen van moleculen kunnen worden bestudeerd. In hoogoplossende varianten praten we dan over hoeveelheden bestudeerde monsters in de grootteorde van attoliters (10-18 l), heel weinig, dus. De spectroscoop meet het licht dat het fluorescerende molecuul uitzendt, aangeslagen door een laserbundel. De doorsnede van de laserbundel is bekend en ook de fluorescentietijd. Dan kan, schijnt het, de snelheid van de afzonderlijke molec

ulen vrij nauwkeurig bepaald worden.
“Het is al enige tijd bekend dat de hoogoplossende fluorescentiecorrelatiespectroscoop (fcs) goed werkt bij het waarnemen van moleculen die in een plat vlak bewegen, zoals lipidemembranen, maar dat gaat mis in drie dimensies”, zegt medeonderzoeker Krzysztof Sozanski. Dat schijnt aan de verschillen in diffusietijden te liggen die gemeten zijn in 3d en die welke voorspeld zijn op basis van metingen voor 2d. Vraag me niet hoe dat precies zit, maar daar gaapt een groot gat tussen. Na een paar maanden denken en onderzoeken, ontdekten de wetenschappers dat dat ligt aan de wel erg simpele wijze waarop de focusgrootte van de laserbundel wordt bepaald.

Nieuwe rekenmodel

Dus knutselden ze een nieuw rekenmodel in elkaar. Belangrijk vinden de onderzoekers dat de analytische methode die ze ontwikkelden dat ze geen andere apparatuur nodig hebben. Er moet wel wat aangepast worden, maar dan kan een onderzoeker dan ook met FCS-STED-microscoop veel nauwkeuriger de gegevens interpreteren dan tot nu toe mogelijk. Hier aangekomen moet ik toegeven dat er wel wat al te veel over de apparatuur/methode wordt gesproken en weinig over de dingen die je er mee kunt. Wordt vervolgd, zullen we maar zeggen…

Bron: EurekAlert

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *

Deze website gebruikt Akismet om spam te verminderen. Bekijk hoe je reactie-gegevens worden verwerkt.