Rubisco (afb: WikiMedia Commons)

Rubisco (ribulose-1,5-bifosfaatcarboxylase/oxygenase) is een belangrijk ingrediënt in de fotosynthese, maar het enzym is nogal traag. MIT-onderzoekers zou door een versnelde ‘evolutie’ de werkzaamheid van rubisco hebben opgevoerd. De opgevoerde (bacteriële) rubisco, normaal gevoelig voor ‘verspillende’ reacties met zuurstof, zou efficiënter werken in zuurstofrijke omgevingen. Uiteindelijk zou die ‘opgevoerde’ fotosynthese kunnen leiden tot hogere oogstopbrengsten maar ook op een snellere vastlegging van kooldoxide.
Tijdens fotosynthese katalyseert rubisco een belangrijke reactie: de opname van koolstofdioxide in organische verbindingen om suikers te creëren. Rubisco, waarvan men denkt dat het het meest voorkomende enzym op aarde is, is echter zeer inefficiënt vergeleken met de andere enzymen die betrokken zijn bij fotosynthese.
Biochemici van het MIT hebben nu aangetoond dat ze een versie van rubisco, die in bacteriën in een zuurstofarme omgeving wordt aangetroffen, aanzienlijk kunnen verbeteren. Met behulp van een proces dat bekend staat als gerichte ‘evolutie’, zagen ze mutaties die de katalytische efficiëntie van rubisco met wel 25% zouden verhogen. De onderzoekers zijn nu van plan hun techniek toe te passen op vormen van rubisco die in planten kunnen worden gebruikt om hun fotosynthese te verhogen, wat mogelijk de gewasopbrengsten zou kunnen verbeteren.
“Dit is, denk ik, een overtuigend bewijs van succesvolle verbetering van de enzymatische eigenschappen van een rubisco, wat veel hoop biedt voor de ontwikkeling van andere vormen van rubisco”, aldus Matthew Shoulders, hoogleraar scheikunde bij het MIT.

Wanneer planten of fotosynthetische bacteriën energie van de zon absorberen, zetten ze deze eerst om in energieopslagmoleculen zoals ATP (adenosinetrifosfaat). In de volgende fase van de fotosynthese gebruiken cellen die energie om de verbinding ribulosebisfosfaat om te zetten in glucose, waarvoor verschillende extra reacties nodig zijn. Rubisco katalyseert de eerste van die reacties, bekend als carboxylering. Tijdens die reactie wordt koolstof uit CO₂ toegevoegd aan ribulosebisfosfaat.
Vergeleken met de andere enzymen die betrokken zijn bij fotosynthese, is rubisco erg traag en katalyseert het slechts één tot tien reacties per seconde. Bovendien kan rubisco ook reageren met zuurstof, wat leidt tot een concurrerende reactie waarbij zuurstof in plaats van koolstof wordt opgenomen – een proces waarbij een deel van de uit zonlicht opgenomen energie verloren gaat.
“Voor eiwitingenieurs is dat een zeer aantrekkelijke reeks problemen, omdat die eigenschappen hopelijk verbeterd kunnen worden door veranderingen aan te brengen in de aminozuursequentie van het enzym”, aldus medeonderzoekster Julie McDonald.

Eerder onderzoek heeft geleid tot verbetering van de stabiliteit en oplosbaarheid van rubisco, wat resulteerde in kleine verbeteringen in de enzymefficiëntie. De meeste van deze studies maakten gebruik van gerichte evolutie – een techniek waarbij een natuurlijk voorkomend eiwit willekeurig wordt gemuteerd en vervolgens wordt geanalyseerd op het ontstaan ​​van nieuwe of betere, gewenste eigenschappen.

Dit proces wordt meestal uitgevoerd met behulp van foutgevoelige polymerasekettingreactie (pkr), een techniek die eerst in glas (buiten de cel) mutaties genereert, waarbij doorgaans slechts één of twee mutaties in het doelgen worden geïntroduceerd.
In eerdere studies naar rubisco werd deze bibliotheek van mutaties vervolgens geïntroduceerd in bacteriën die groeien met een snelheid die relatief is aan de rubisco-activiteit. Beperkingen in foutgevoelige pkr en in de efficiëntie van het introduceren van nieuwe genen beperken het totale aantal mutaties dat met deze aanpak kan worden gegenereerd en gevonden. Handmatige mutagenese en selectiestappen verlengen het proces gedurende vele ‘evolutierondes’.

Mutagenese

De onderzoekers gebruikten in plaats daarvan een nieuwere mutagenesetechniek (genoomverandering) die eerder door de Shouldersgroep was ontwikkeld, genaamd MutaT7. Deze techniek stelt de onderzoekers in staat om zowel mutagenese als analyse uit te voeren in levende cellen, wat het proces aanzienlijk versnelt. Hun techniek stelt hen ook in staat om het doelgen sneller te muteren.
“Onze techniek van continue gerichte evolutie stelt ons in staat om veel meer mutaties in het enzym te bekijken dan voorheen”, aldus McDonald.

Voor deze studie begonnen de onderzoekers met een versie van rubisco, geïsoleerd uit een familie van semi-anaerobe bacteriën die bekend staat als Gallionellaceae. Dit is een van de snelste rubisco’s die in de natuur voorkomen. Tijdens de experimenten met gerichte evolutie, die werden uitgevoerd met Escherichia coli-bacteriën, hielden de onderzoekers de beestjes in een omgeving met atmosferische zuurstofniveaus, waardoor er evolutionaire druk ontstond om zich aan te passen aan zuurstof.
Na zes ronden van gerichte evolutie identificeerden de onderzoekers drie verschillende mutaties die de weerstand van rubisco tegen zuurstof verbeterden. Elk van deze mutaties bevindt zich in de buurt van de actieve plaats van het enzym (waar het carboxylering of oxygenatie uitvoert). De onderzoekers denken dat deze mutaties het vermogen van het enzym verbeteren om bij voorkeur met koolstofdioxide te reageren in plaats van met zuurstof, wat leidt tot een algehele toename van de carboxyleringsefficiëntie.

“De onderliggende vraag hier is: Kun je de kinetische eigenschappen van rubisco veranderen en verbeteren om beter te functioneren in omgevingen waar je dat wilt?”, zegt Shoulders. “Wat veranderde door het proces van gerichte evolutie, was dat rubisco minder graag met zuurstof reageerde. Daardoor kan rubisco goed functioneren in een zuurstofrijke omgeving, waar het normaal gesproken constant afgeleid zou raken en met zuurstof zou reageren, wat je niet wilt.”

Fotorespiratie

In lopend onderzoek passen de onderzoekers deze aanpak toe op andere vormen van rubisco, waaronder het enzym dat van planten afkomstig is. Het idee is dat planten ongeveer 30% van de energie uit het zonlicht dat ze absorberen verliezen via fotorespiratie, dat plaatsvindt wanneer rubisco inwerkt op zuurstof in plaats van op koolstofdioxide.
“Dit opent echt de deur naar veel spannend nieuw onderzoek, en het is een stap verder dan de technieken die in het verleden de rubisco-techniek domineerden”, zegt medeonderzoeker Robert Wilson. “Er zijn duidelijke voordelen voor de landbouwproductiviteit die benut kunnen worden door een betere rubisco.”

Bron: Science Daily